Эффективность получения сексированных эмбрионов КРС методом in vitro

Получение эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro - современный и прогрессивный биотехнологический метод, позволяющий значительно ускорить процесс  воспроизводства высокопродуктивных животных. Данный метод состоит из нескольких этапов: извлечение ооцитов из антральных фолликулов яичника (OPU), созревания ооцитов (IVM – in vitro maturation);  оплодотворения (IVF – in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC – in vitro culture). Важным аспектом данной технологии является то, что получать яйцеклетки от животных доноров можно как прижизненно, используя метод трансвагинальной аспирации, так и от убойного материала (яичники коров с мясокомбината).  Получение разделённых по полу  эмбрионов - востребованный и перспективный метод, который  заключается в оплодотворении  яйцеклеток сексированной спермой быков. Оплодотворение яйцеклеток разделённой по полу спермой  в отличие от обычной  даёт возможность получать особей желательного пола  с вероятностью до 93 %.  Помимо возможностей в области селекции данный метод имеет и ряд экономических преимуществ, а именно: при  пересадке эмбрионов, не разделённых по полу, частота рождения бычков составляет до 55%.  Что имеет немаловажное значение в молочном скотоводстве, где есть большая потребность в ремонтных тёлочках с высокой молочной продуктивностью.

Исходя из этого перед коллективом лаборатории  ООО «Бетагран- Липецк» была поставлена задача направленная на  создание оптимального протокола оплодотворения и культивирования доимплонтированных эмбрионов  in vitro.  Для этого ооциткумулюсные комплексы получали прижизненно из антарльных фолликулов диаметром 2-6 мм от коров доноров методом TAU (транс вагинальной аспирации. После  чего ооциткумулюсные комплексы помещались в среду дюльбекко с добавлением с 5%  эстральной сыворотки, 4% р-ра гентамицина и р-ра. гепарина. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 200 кратном увеличении. Для  экспериментов  отбирали  ооциты  средней  величины  с мелкозернистой  ооплазмой, окруженные  компактным  многослойным кумулюсом. Для  дозревания  ооцитов  использовали  среду  199  (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10%  эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата,  BSA, 1.0 ЕД  /  мл  лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона,  1,0мкг  /  мл  эстрадиола (спиртовой раствор) и  50 мкг / мл гентамицина.

Ооциты помещали в лунки планшетов в среду созревания в объёмом 500 мкл  под  минеральным  маслом  (“Sigma”,  США)  и  культивировали  в течение  20-24  часов при  температуре  38,5-39  в  атмосфере  5  %  CO2 в воздухе. Для оплодотворения использовали разделённое по полу  криоконсервированное семя быков в пайэтах объёмом 0,25 мл из расчёта 1 доза на 30 яйцеклеток. Оттаивание  производили при температуре + 37 º С в течении 40 секунд. По той же схеме оттаивалось и обычное семя быков.  Получение  подвижной  фракции  сперматозоидов  проводили  путём центрифугирования в градиенте плотности (р-р перколла) при оборотах ротора центрифуги 300G. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности был больше, чем при использовании метода флотации (Swim Up). Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой Fert-TALP  объёмом 80 мкл.  И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при  температуре  38,5-39  в  атмосфере с содержанием 5  %  CO2.

После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF  c добавлением BSA, MEM vitamins,   MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом  (  Sigma ,США)  и культивировали при температуре 38,5º С  в увлажненной  атмосфере  под газовой  фазой (по  5% CO2  и  O  2  и  90 % N2) в течение 7-8 суток.  Количество оплодотворённых зигот подсчитывали через 48 и 62 часа после оплодотворения.

Для определения эффективности оплодотворения сексированной спермы использовалось заморожено-оттаянное семя пяти быков. Было оплодотворено 1050 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 944 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 89,93%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%

Таблица 1 Оплодотворяемость и выход эмбрионов сексированное семя

Во втором случае   использовалось обычное  заморожено-оттаянное семя от четырёх быков. Было оплодотворено 770 яйцеклеток, полученных методом OPU. Из них у 708 началось дробление, средний процент дробящихся яйцеклеток составил 91,94%. Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание  яйцеклеток составил 35,58%

Таблица 2 Оплодотворяемость и выход эмбрионов обычное семя

Таблица 3 Сравнительная характеристика и эффективность использования сексированного и традиционного семени при производстве эмбрионов  in vitro.

Так разница составила  2,01% в пользу обычного семени. Выход эмбрионов был больше на 6,16 в пользу обычного семени. Несмотря на то, что культивирование эмбрионов производилось на одной культуральной системе, количество полученных эмбрионов in vitro было выше в группе, где использовалось обычное семя. Мы предполагаем, что это связанно с окрашиванием сперматозоидов флуоресцентной краской, из-за чего снижается энергетический запас, что и может обуславливать меньший жизненный потенциал гамет  по сравнению с обычным семенем,  как следствие - остановку развития некоторых эмбрионов.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанный протокол оплодотворения и культуральная система обладает высоким потенциалом и позволяет получать в массовом количестве разделённые по полу эмбрионы по технологии in vitro. А так же  может использоваться для получения, зигот и предимплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.